復蘇金黃色葡萄球菌SAATCC6538、銅綠假單胞菌ATCC15442、大腸桿菌ATCC8099，并分別接種于營養瓊脂培養基中，持續培養18～24h。于菌株培養后，使用無菌接種環挑取培養物，置于0.85%無菌生理鹽水中，制成細菌換懸液，并以麥氏比濁法適當調節細菌含量(5×10⁵～5×10⁶cfu)。

使用臭氧水生成器制備臭氧水后，取容量為1L的大燒杯，于充分清洗、消毒后，以臭氧水沖洗3次，每次3min，然后用于連續接取4份臭氧水，分別置于4℃、10℃、23℃、30℃恒溫實驗箱中，觀察不同時間臭氧水濃度(mg/L)變化情況，分析臭氧水在不同溫度條件中的穩定性。

碘量法檢測原理：臭氧能夠和碘化鉀水溶液發生反應，并游離出碘。于臭氧水配置后獲取樣本，使用0.01mol/L硫代硫酸鈉溶液(硫代硫酸鈉標準溶液)滴定游離碘，計算硫代硫酸鈉消耗量即可得出臭氧量。具體反應公式如下：

O₃+2KI→O₂+I₂+2KOH

I₂+2Na₂S₂O₃→2Nal+Na₂S₄O₃

碘量法具體檢測步驟：獲取100mL臭氧水，將其轉移到500mL容量瓶當中，并加入20mL碘化鉀溶液、10mL硫酸溶液，以緩慢晃動方式使液體完全混勻，然后加入硫代硫酸鈉標準溶液，持續滴定至顏色消失，一邊滴定一邊輕柔晃動。于滴定結束后，統計硫代硫酸鈉標準溶液使用量。臭氧量(C)計算公式如下：

C=2.4×L(其中L為硫代硫酸鈉標準溶液使用量，單位mL)

使用臭氧水生成器制備2mg/L的臭氧水溶液，以金黃色葡萄球菌為例，進行中和劑實驗，以選擇理想中和劑。以《醫院消毒技術規范》中的相關規定為依據，將實驗設置為6組。中和劑實驗分組及方法。見表1。

分別在6組中獲取10μL溶液，并將所獲取溶液接種至營養瓊脂培養基，于37℃厭氧培養箱(80%N₂+10%H₂+10CO₂)中持續培養72h，統計細菌數量，根據觀察、統計情況分析中和劑作用。滿足下述條件認為中和劑適合應用于實驗當中：(1)a組細菌不生長，或細菌數量＜b組；(2)b組細菌數量＜100cfu/mL；(3)c、d、e三組細菌數量相差＜10%；(4)f組細菌不生長。

使用臭氧水生成器制備2mg/L的臭氧水溶液，按照不稀釋、1倍稀釋、2倍稀釋順序獲得2mg/L、1mg/L、0.5mg/L 臭氧水，留待使用。取兩支試管，分別標記實驗組1、實驗組2。實驗組1：獲取4mL臭氧水，加入0.5mL菌液，充分混勻，反應至規定觀察時間后，獲取0.5mL臭氧水和菌液的混合液，加入4.5mL中和劑，充分混合，獲取0.5mL混合液，進行瓊脂傾注培養(2份)，在48℃厭氧培養箱中持續培養48h，觀察并統計細菌數量(cfu)。實驗組2：將臭氧水換為等量蒸餾水，其他操作均與實驗組1相同。每種濃度臭氧水及實驗組2均重復實驗3次，取平均數。根據實驗組1、實驗組2細菌數量(cfu)計算殺菌率。

殺菌率=(實驗組2細菌數量-實驗組1細菌數量)實驗組2細菌數量

1.3

觀察指標

應用SPSS 26.0系統分析，計數資料以(n，%)形式表示，χ2檢驗；計量資料以(均數±標準差)形式表示，t檢驗；檢驗水準P＜0.05。

臭氧水穩定性與溫度有關，隨著溫度升高，臭氧水濃度衰竭速度加快、半衰期縮短。

3.2

 臭氧水對于主要慢性骨髓炎病原菌的殺滅效果分析

本次研究結果顯示，臭氧水對于金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌的殺滅效果各不相同。隨著臭氧水濃度升高，對于上述三種病原菌的殺滅作用增強。1.0mg/L臭氧水作用30s能夠100%殺滅大腸桿菌；2.0mg/L臭氧水作用30s能夠100%殺滅銅綠假單胞菌；而0.5、1.0、2.0mg/L臭氧水都不能在作用30s內完全殺滅金黃色葡萄球菌，使用2.0mg/L臭氧水需要作用1min能夠100%殺滅葡萄球菌。這與不同病原菌細胞膜厚度、細胞結構、細胞成分差異有關。

臭氧水對于各種病原菌的殺傷性既與其自身穩定性、濃度水平有關，又與病原菌種類有關。慢性骨髓炎病原菌種類多樣，革蘭陽性菌中以金黃色葡萄球菌為主要代表，革蘭陰性菌中以銅綠假單胞菌、大腸桿菌為主。本次研究中臭氧水對于金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌均具有殺傷作用。其中對于兩種革蘭陰性菌的殺滅作用稍強，對銅綠假單胞菌應用2.0mg/L臭氧水作用30s殺菌率達到100%；對大腸桿菌應用1.0mg/L臭氧水作用30s殺菌率達到100%。對于金黃色葡萄球菌的殺滅作用相對較弱，滅菌效果最好、最快的方案為使用2.0mg/L臭氧水作用1min。對于不同濃度臭氧水的殺菌效果問題，不同研究者得出的結論各不相同。如索標等^[11]研究指出，2.0mg/L、8.0mg/L 臭氧水對金黃色葡萄球菌作用1min，殺菌率均達到100%。魯建云等^[12]研究顯示，0.3mg/L臭氧水對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌作用1min，殺菌率均達到100%。葉菊花等^[13]指出，1.0mg/L臭氧水作用銅綠假單胞菌1min，就能完全殺滅病原菌；Marcia DOSS^[14]研究中，1.0mg/L臭氧水作用大腸桿菌30s，殺菌率100%。綜合分析大量研究資料，可以發現，在同樣條件狀態下，臭氧水對于革蘭陰性菌的殺滅作用優于革蘭陽性菌。這可能與兩類病原菌結構特點有關。革蘭陰性菌厚度相對較低，肽聚糖含量少，且為單層肽聚糖結構，網絡較疏松，不含有多糖，而且革蘭氏陰性細菌不能形成芽孢，臭氧對于該類細菌的穿透力更強，殺菌作用更好。而革蘭陽性菌中很多細菌能夠形成芽孢，細胞中非細胞壁結構較厚，存在多層肽聚糖，網絡較為緊密、堅固，臭氧的穿透力會受到一定影響。本次研究結果符合一般研究規律。不同研究者的研究結果存在差異與多種因素有關，如：研究地點、時間、當地抗生素應用情況、研究中應用的實驗方法及實驗條件等。本次研究在規范研究基礎上，探究臭氧水對于三種主要慢性骨髓炎病原菌的殺滅作用，能夠為進一步實驗研究的開展準備條件，以便開展臭氧水灌注負壓吸引治療大鼠股骨慢性骨髓炎實驗時，指導臨床合理配置臭氧水、科學選擇制備大鼠股骨慢性骨髓炎模型所需病原菌。