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        臭氧水對慢性骨髓炎常見病原菌滅菌作用的實驗研究

        塔依爾江·亞生1,艾尼·米吉提2,艾合買提江·玉素甫3
        (1新疆醫科大學第六附屬醫院創傷骨科,烏魯木齊 830001;2新疆喀什地區第二人民醫院骨科,新疆喀什 844000;3新疆醫科大學第一附屬醫院骨科中心顯微修復外科 烏魯木齊 830054)



        摘要
        目的 觀察臭氧水的穩定性及對慢性骨髓炎最常見三種病原菌的體外滅菌效果,為臭氧水治療慢性骨髓炎提供初步的理論依據。
        方法 1、制備臭氧水,分別置于不同溫度的恒溫實驗箱,觀察不同時間臭氧水濃度變化情況。2、將2mg/L的臭氧水溶液稀釋,獲得不同濃度的臭氧水。取兩組。實驗組1:獲取4mL臭氧水,加入0.5mL菌液,再加入4.5mL中和劑,獲取混合液進行培養,觀察并統計細菌數量。實驗組2:將臭氧水換為等量蒸餾水,其他操作均與實驗組1相同。每種濃度臭氧水及實驗組2均重復實驗3 次,取平均數。根據實驗組1、2細菌數量計算殺菌率。
        結果 臭氧水穩定性與溫度相關,隨著溫度升高,臭氧水濃度衰竭速度加快、半衰期縮短。應用濃度1.0mg/L的臭氧水2min,或應用濃度2.0mg/L的臭氧水1min,可以完全殺滅金黃色葡萄球菌;應用濃度1.0mg/L的臭氧水2min,或2.0mg/L臭氧水30s,可以完全殺滅銅綠假單胞菌;應用濃度1.0mg/L或2.0mg/L臭氧水30s,可以完全殺滅大腸埃希菌。
        結論 臭氧水具有不穩定性,其濃度會受溫度、時間影響;臭氧水對于三種慢性骨髓炎主要病原菌都具有殺滅作用。
        關鍵詞 臭氧水、慢性骨髓炎、病原菌、殺菌率

        臭氧,最早由Schorbein(德國人)在1840年發現并予以命名。臭氧,是天然的廣譜、高效殺菌劑,能夠快速殺滅多種細菌、病毒、微生物,其主要機制為:臭氧作為一種氧化性物質,能夠在非常短的時間內對細菌、病毒、微生物的內部生物結構造成破壞,使其凋亡[1]。與其他具有氧化性殺菌作用的物質相比,臭氧的殺菌性能更強、作用時間更短,而且殺菌后剩余臭氧可以在短時間內分解為氧氣,進入機體循環當中,不會對人體造成危害[2]。臭氧可以溶解在水中,其溶解度約是氧氣的10倍,將臭氧溶于水,配置成臭氧水也同樣能夠發揮臭氧的殺菌作用,更便于臨床應用和控制[3]。臭氧水抗菌治療為學界關注的熱點問題。分析慢性骨髓炎病原學相關研究資料,可以發現,慢性骨髓炎病原菌種類多樣,以革蘭陽性菌和革蘭陰性菌為主,其中常見的三種病原菌為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌[4-6]。因此,理想的慢性骨髓炎治療方法必須對上述主要病原菌有較強的殺滅作用。本實驗以三種慢性骨髓炎常見致病菌株為例,開展臭氧水殺菌實驗,初步判斷臭氧水對于骨髓炎常見病原菌的殺滅作用,以為進一步研究的開展奠定基礎。




        資料與方法



        1.1
        實驗材料
        圖片
        1.1.1菌株來源

        金黃色葡萄球菌SAATCC6538;銅綠假單胞菌ATCC15442;大腸桿菌ATCC8099。上述菌株均來源于中國普通微生物菌種保藏中心。

        1.1.2臭氧水制備

        使用臭氧,生成臭氧,然后將臭氧與純凈水混合,形成臭氧水。實驗期間,以碘量法檢測臭氧水濃度,并將配置臭氧水前使用的自來水設置為空白實驗組2,進行對照分析,以避免自來水中原有氧氣干擾檢測結果。

        1.2
        方法
        圖片
        1.2.1 菌液制備

        復蘇金黃色葡萄球菌SAATCC6538、銅綠假單胞菌ATCC15442、大腸桿菌ATCC8099,并分別接種于營養瓊脂培養基中,持續培養18~24h。于菌株培養后,使用無菌接種環挑取培養物,置于0.85%無菌生理鹽水中,制成細菌換懸液,并以麥氏比濁法適當調節細菌含量(5×105~5×106cfu)。

        1.2.2 臭氧水穩定性檢測

        使用臭氧水生成器制備臭氧水后,取容量為1L的大燒杯,于充分清洗、消毒后,以臭氧水沖洗3次,每次3min,然后用于連續接取4份臭氧水,分別置于4℃、10℃、23℃、30℃恒溫實驗箱中,觀察不同時間臭氧水濃度(mg/L)變化情況,分析臭氧水在不同溫度條件中的穩定性。

        碘量法檢測原理:臭氧能夠和碘化鉀水溶液發生反應,并游離出碘。于臭氧水配置后獲取樣本,使用0.01mol/L硫代硫酸鈉溶液(硫代硫酸鈉標準溶液)滴定游離碘,計算硫代硫酸鈉消耗量即可得出臭氧量。具體反應公式如下:

        O3+2KI→O2+I2+2KOH

        I2+2Na2S2O3→2Nal+Na2S4O3

        碘量法具體檢測步驟:獲取100mL臭氧水,將其轉移到500mL容量瓶當中,并加入20mL碘化鉀溶液、10mL硫酸溶液,以緩慢晃動方式使液體完全混勻,然后加入硫代硫酸鈉標準溶液,持續滴定至顏色消失,一邊滴定一邊輕柔晃動。于滴定結束后,統計硫代硫酸鈉標準溶液使用量。臭氧量(C)計算公式如下:

        C=2.4×L(其中L為硫代硫酸鈉標準溶液使用量,單位mL)

        1.2.3 中和劑實驗

        使用臭氧水生成器制備2mg/L的臭氧水溶液,以金黃色葡萄球菌為例,進行中和劑實驗,以選擇理想中和劑。以《醫院消毒技術規范》中的相關規定為依據,將實驗設置為6組。中和劑實驗分組及方法。見表1。

        分別在6組中獲取10μL溶液,并將所獲取溶液接種至營養瓊脂培養基,于37℃厭氧培養箱(80%N2+10%H2+10CO2)中持續培養72h,統計細菌數量,根據觀察、統計情況分析中和劑作用。滿足下述條件認為中和劑適合應用于實驗當中:(1)a組細菌不生長,或細菌數量<b組;(2)b組細菌數量<100cfu/mL;(3)c、d、e三組細菌數量相差<10%;(4)f組細菌不生長。

        1.2.4 殺菌實驗

        使用臭氧水生成器制備2mg/L的臭氧水溶液,按照不稀釋、1倍稀釋、2倍稀釋順序獲得2mg/L、1mg/L、0.5mg/L 臭氧水,留待使用。取兩支試管,分別標記實驗組1、實驗組2。實驗組1:獲取4mL臭氧水,加入0.5mL菌液,充分混勻,反應至規定觀察時間后,獲取0.5mL臭氧水和菌液的混合液,加入4.5mL中和劑,充分混合,獲取0.5mL混合液,進行瓊脂傾注培養(2份),在48℃厭氧培養箱中持續培養48h,觀察并統計細菌數量(cfu)。實驗組2:將臭氧水換為等量蒸餾水,其他操作均與實驗組1相同。每種濃度臭氧水及實驗組2均重復實驗3次,取平均數。根據實驗組1、實驗組2細菌數量(cfu)計算殺菌率。

        殺菌率=(實驗組2細菌數量-實驗組1細菌數量)實驗組2細菌數量

        1.3
        觀察指標
        圖片
        觀察以下指標:(1)分析不同溫度條件下,臭氧水濃度變化情況;(2)分析中和劑實驗結果;(3)分析不同濃度臭氧水對于金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌的殺菌作用。
        1.4
        統計學分析
        圖片

        應用SPSS 26.0系統分析,計數資料以(n,%)形式表示,χ2檢驗;計量資料以(均數±標準差)形式表示,t檢驗;檢驗水準P<0.05。




        結果



        2.1
        臭氧水穩定性分析

        臭氧水穩定性與溫度有關,隨著溫度升高,臭氧水濃度衰竭速度加快、半衰期縮短。

        2.2
        中和劑實驗結果分析
        圖片

        重復3次中和劑實驗結果顯示,0.5%硫代硫酸鈉(Na2S2O2)的磷酸鹽緩沖液能夠有效中和臭氧水,中和劑對細菌生長未產生明顯影響,也未發現中和產物對細菌生長產生明顯影響。見表4。

        2.3
        不同濃度臭氧水殺菌效果分析
        圖片
        2.3.1 臭氧水對金黃色葡萄球菌的殺滅作用

        對于金黃色葡萄球菌,應用濃度0.5mg/L的臭氧水,作用30s~3min的平均殺菌率在91.27%~95.26%之間,均未達到100%;應用濃度1.0mg/L的臭氧水,作用2min時殺菌率達到100%;應用濃度2.0mg/L的臭氧水,作用1min時殺菌率達到100%。見表5、圖3。

         

         

        2.3.2 臭氧水對銅綠假單胞菌的殺滅作用

        對于銅綠假單胞菌,應用濃度0.5mg/L的臭氧水,作用30s~3min的平均殺菌率在90.24%~94.89%之間,均未達到100%;應用濃度1.0mg/L的臭氧水,作用2min時殺菌率達到100%;應用濃度2.0mg/L的臭氧水,作用30s時殺菌率達到100%。見表6、圖4。

         

        2.3.3 臭氧水對大腸桿菌的殺滅作用

        對于大腸桿菌,應用濃度0.5mg/L的臭氧水,作用30s~3min的平均殺菌率在90.37%~95.12%之間;應用濃度1.0mg/L的臭氧水,作用30s時殺菌率達到100%;應用濃度2.0mg/L的臭氧水,作用30s時殺菌率達到100%。



        討論



        細菌感染,是目前全世界面臨的重要公共衛生問題,隨著各種抗生素的不斷增多及抗生素濫用問題演化,細菌感染控制難度進一步提升,嚴重損害人類生命健康[7]。臭氧(O3)為強氧化劑,在目前發現的物質中,臭氧的氧化性僅次于氟,是一種廣譜、高效、快速殺菌劑。醫用臭氧的發明及應用為細菌感染的預防及治療提供了新思路。臭氧的分子結構極其不穩定,能夠分解為穩態氧離子(O2)、單一新生態氧原子(O)、羥基(OH),其中O、OH均具有極強氧化能力,為理想的溶菌物質,能夠在短時間內進入細菌、病毒、微生物當中,破壞其內部結構,殺滅致病菌[8]。

        臭氧在水中具有高溶解率,臭氧進入水中后,部分臭氧分子(O3)進入水中,還有許多臭氧分子能夠在分解后和水分子(H2O)結合,合成具有更強氧化性的羥基(OH-),羥基被視為可以在水中作用、最活躍的氧化劑,能夠氧化多種大分子生物(脂肪酸、蛋白質、多糖、氨基酸、核酸等),不只是單獨破壞某一種細菌結構,因此具有廣譜抗菌、殺菌作用,而且不會發生耐藥[9]。本次開展臭氧水殺菌實驗,以慢性骨髓炎常見病原菌菌株(金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌)為例,分析臭氧水對于上述病原菌的殺滅效果。以下結合本次研究數據,對臭氧水的穩定性特點、殺滅骨髓炎病原菌效果進行討論分析,為后續實驗開展奠定基礎。

        3.1
        臭氧水的穩定性分析
        圖片

        本次研究顯示,臭氧水中臭氧濃度與溫度及時間有關。隨著溫度條件的升高,臭氧水穩定性變差,濃度衰減速度加快。4℃時平均半衰期為131.05min,10℃時平均半衰期為129.73min,23℃時平均半衰期為20.81min,30℃時平均半衰期為6.21min。這與徐貞杰等[10]的結論較為一致。臭氧水濃度隨溫度、時間變化而變化的特點與臭氧水的穩定性差有關。

        臭氧為不穩定物質,容易分解成為氧氣,其殺菌作用也會受到影響。隨著溫度升高、時間延長,臭氧水的穩定性變差,殺菌性能降低。因此,臨床中應使用新鮮配置臭氧水,并避免高溫放置,以免隨著時間延長、溫度升高,臭氧水濃度降低,影響作用效果。23℃為一般室溫條件,其半衰期為20.81min,提示室溫條件下配置的臭氧水應盡量在20min內使用,否則其作用效果將大大減弱。

        3.2
         臭氧水對于主要慢性骨髓炎病原菌的殺滅效果分析
        圖片

        本次研究結果顯示,臭氧水對于金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌的殺滅效果各不相同。隨著臭氧水濃度升高,對于上述三種病原菌的殺滅作用增強。1.0mg/L臭氧水作用30s能夠100%殺滅大腸桿菌;2.0mg/L臭氧水作用30s能夠100%殺滅銅綠假單胞菌;而0.5、1.0、2.0mg/L臭氧水都不能在作用30s內完全殺滅金黃色葡萄球菌,使用2.0mg/L臭氧水需要作用1min能夠100%殺滅葡萄球菌。這與不同病原菌細胞膜厚度、細胞結構、細胞成分差異有關。

        臭氧水對于各種病原菌的殺傷性既與其自身穩定性、濃度水平有關,又與病原菌種類有關。慢性骨髓炎病原菌種類多樣,革蘭陽性菌中以金黃色葡萄球菌為主要代表,革蘭陰性菌中以銅綠假單胞菌、大腸桿菌為主。本次研究中臭氧水對于金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌均具有殺傷作用。其中對于兩種革蘭陰性菌的殺滅作用稍強,對銅綠假單胞菌應用2.0mg/L臭氧水作用30s殺菌率達到100%;對大腸桿菌應用1.0mg/L臭氧水作用30s殺菌率達到100%。對于金黃色葡萄球菌的殺滅作用相對較弱,滅菌效果最好、最快的方案為使用2.0mg/L臭氧水作用1min。對于不同濃度臭氧水的殺菌效果問題,不同研究者得出的結論各不相同。如索標等[11]研究指出,2.0mg/L、8.0mg/L 臭氧水對金黃色葡萄球菌作用1min,殺菌率均達到100%。魯建云等[12]研究顯示,0.3mg/L臭氧水對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌作用1min,殺菌率均達到100%。葉菊花等[13]指出,1.0mg/L臭氧水作用銅綠假單胞菌1min,就能完全殺滅病原菌;Marcia DOSS[14]研究中,1.0mg/L臭氧水作用大腸桿菌30s,殺菌率100%。綜合分析大量研究資料,可以發現,在同樣條件狀態下,臭氧水對于革蘭陰性菌的殺滅作用優于革蘭陽性菌。這可能與兩類病原菌結構特點有關。革蘭陰性菌厚度相對較低,肽聚糖含量少,且為單層肽聚糖結構,網絡較疏松,不含有多糖,而且革蘭氏陰性細菌不能形成芽孢,臭氧對于該類細菌的穿透力更強,殺菌作用更好。而革蘭陽性菌中很多細菌能夠形成芽孢,細胞中非細胞壁結構較厚,存在多層肽聚糖,網絡較為緊密、堅固,臭氧的穿透力會受到一定影響。本次研究結果符合一般研究規律。不同研究者的研究結果存在差異與多種因素有關,如:研究地點、時間、當地抗生素應用情況、研究中應用的實驗方法及實驗條件等。本次研究在規范研究基礎上,探究臭氧水對于三種主要慢性骨髓炎病原菌的殺滅作用,能夠為進一步實驗研究的開展準備條件,以便開展臭氧水灌注負壓吸引治療大鼠股骨慢性骨髓炎實驗時,指導臨床合理配置臭氧水、科學選擇制備大鼠股骨慢性骨髓炎模型所需病原菌。




        小結



        基于臭氧水殺菌實驗,本研究認為臭氧水具有不穩定性,其濃度會受實驗溫度、時間影響,因此在應用臭氧水開展實驗、進行治療時,應注意應用新鮮配置臭氧水,并盡量降低臭氧水應用溫度,在室溫條件下,應盡量在臭氧水配置20min內應用。另外,本實驗證實臭氧水對于三種慢性骨髓炎主要病原菌都具有殺滅作用,2.0mg/L臭氧水作用1min對于三種主要骨髓炎病原菌的殺滅作用均能達到100%。

         
         

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